C57BL/6小鼠

1.1玻璃颅窗动物模型的手术制备

采用8-12周的小鼠进行实验，用异氟烷气体麻醉诱导，术中麻醉采用腹腔注射氯胺酮、甲苯嗪和盐酸苯甲酸盐（注射剂量0.0375/0.0375/0.000125 mg/g）麻醉小鼠。皮下注射青霉素（40 mg/kg）减少感染。小鼠麻醉完全后，使用脱毛膏除净小鼠头部的毛发。随后将小鼠固定在立体定位仪上。使用眼膏以避免小鼠眼部脱水和刺激。剪去头皮，使用颅钻轻轻磨去颅骨，用镊子挑去硬脑膜（图1-A）。用直径6 mm的透明颅窗覆盖大脑，并用牙科水泥乙基氰基丙烯酸酯液体（以下简称牙科水泥）密封（图1-B）。术后皮下注射4针镇痛药：每隔6小时注射一剂美洛昔康注射液（0.1 mg/kg）。

1.2胶质瘤活体动物模型制备方法

制备使用玻璃颅窗替代颅骨的小鼠，4周后除去小鼠脑表的玻璃片与固定环，用PBS制备2500 个/ μl的浓度GL261-CFP细胞悬液，使用10 µl的汉密尔顿微量注射器和2 pt型针头，与水平面成60°的方向将2 µl含5×10³ GL-261-CFP细胞的细胞悬液以0.5 mm/min的速度立体定向注射到小鼠脑内（图1-C），进针深度1.5 mm，停留2分钟后，退至1 mm深度，以0.5 μl/min注射2 μl 肿瘤细胞悬液，注射完停针5 min后缓慢退针。注射点位于矢状窦外侧约1 mm，前囟前方约2 mm，脑实质内深度1 mm（图1-D）。注射完毕后停留5分钟后，以1 mm/min的速度退针。使用生理盐水清洁脑表，使用牙科水泥粘住玻璃圆片与固定环。术后皮下注射4针镇痛药：每隔6小时注射一剂美洛昔康注射液（0.1 mg/kg）。使用CFP慢病毒感染的GL261细胞用500 μg/ml G418筛选至CFP稳定表达，GL261-CFP在荧光显微镜下发出青蓝色荧光（图1-E）。

1.3 双光子显微镜观察

图像采集使用徕卡TCS SP8 DIVE共聚焦显微镜，配备变色龙超激光系统（680-1300 nm）和25×水浸物镜（数值孔径0.95，徕卡）。单幅图像采集深度为0-300 μm, z-间隔为3 μm。为了显示脑血管，通过小鼠尾静脉注射10 mg/ml的FITC-dextran（2×10⁶分子量，绿色，Sigma-Aldrich）0.2 ml。FITC-dextran激发波长为975 nm, GL261-CFP激发波长为860 nm，1024×1024像素。FITC-dextran的发射波长为500-550 nm, GL261-CFP肿瘤细胞的发射波长为450-490 nm。用异氟醚麻醉小鼠，以0.8% ~ 2.0%（根据小鼠身体状况尽可能低的流量）的恒定流量（1 ml/min）维持。激光功率也限制在最低百分比，尽量避免光毒性。

2.1 双光子显微镜-胶质瘤荧光示踪小鼠模型

如图2-A所示，第7天通过双光子显微镜观察到胶质瘤侵袭增殖，肿瘤细胞GL261-CFP呈现青蓝色荧光，血管呈现绿色荧光；第10天观察到胶质瘤形成多发性病灶，第14天观察到胶质瘤占位明显，肿瘤内血管失去正常形态。选取3只小鼠第7天至第14天的300 μm×300 μm×300 μm 大小的区域跟踪分析统计，观察到胶质瘤内血管紊乱。至第14天，破碎的血管脉络增多、新生血管形成。小鼠脑胶质瘤的HE染色（虚线所示）可见多形性胶质瘤细胞，细胞核增大深染，胞浆嗜酸性染色阳性（图-2B）。

A

注：A：动态跟踪拍摄胶质瘤（青蓝色）增殖侵袭与脑血管（绿色）的变化；B：HE染色显示多形性胶质瘤细胞，细胞核增大深染，胞浆嗜酸性染色阳性。

图2双光子显微镜-胶质瘤荧光示踪小鼠模型的表性特征

2.2 核磁成像跟踪小鼠胶质瘤生长变化

考虑到胶质瘤生长的深度和广度可能会超过双光子成像的检测范围，同时应用核磁成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）跟踪观察了小鼠颅内胶质瘤的生长变化情况。如图3所示，MRI跟踪了不同时间节点同一冠状面胶质母细胞瘤的生长情况。第20天和26天MRI图像显示胶质瘤分成几部分生长，而到第32天时几部分界限已不清晰，长成为较大且均一的实体瘤灶。在获取了不同时间节点小鼠胶质瘤MRI影像学数据后，应用Imaris软件对胶质瘤进行了三维立体重构：如图3所示，红色表示重构的胶质瘤区域，其余部分为正常脑组织。对胶质瘤重构计算发现其体积明显上升。

综上，结合双光子与MRI技术，可以动态跟踪观察到小鼠胶质瘤在细胞水平和整体组织水平的变化情况，并能反映临床胶质瘤增殖速度快、侵袭性高及血管增生等特点。双光子显微镜-胶质瘤荧光示踪小鼠模型能够精确地从细胞层面上观察到胶质瘤侵袭增殖的过程，以及肿瘤内血管结构的变化，完整地示踪了胶质瘤与脑血管的动态变化。

图3 MRI跟踪小鼠胶质瘤生长变化